Wprowadzenie

 

Jak wiemy z poprzednich artykułów pożywki używane do hodowli in-vitro są bardzo dobrym miejscem do rozwoju mikroorganizmów. Jest to niepożądane, ponieważ  konkurenci powodują obumieranie roślin. W związku z tym musimy pracować w taki sposób, by uniemożliwić im dostanie się do pojemników hodowlanych. Jak ? Przecież występują wszędzie, są na naszych dłoniach, w powietrzu i w każdym innym możliwy miejscu? Zapowiada się na zadanie wymagające ogromnego budżetu, wyspecjalizowanego laboratorium i sztabu naukowców. Nic bardziej mylnego ;) Każdy może niskim nakładem kosztów zapewnić sobie miejsce pracy sterylnej we własnym domu.

Miejsce pracy

Podstawową sprawą jest znalezienie obszaru, gdzie powietrze będzie wolne od "latających" mikroorganizmów. Niestety w domu nie ma takich miejsc, ale bardzo łatwo można je stworzyć samemu.

Pierwszą kwestią jest ustalenie miejsca, gdzie będziemy pracować. Ważne jest to, byśmy mieli tam zapewniony całkowity spokój i ograniczony ruch powietrza. Domownicy zaglądający przez ramię są bardzo złym pomysłem, tak samo jak otwarte okno i drzwi, co będzie powodować zwiększoną cyrkulację powietrza. Idealnym miejscem wydaje się kuchnia, bądź zamykana piwnica/strych. Było by idealnie gdybyśmy mieli tam  dostęp do bieżącej wody (nie jest to jednak konieczne).

Właściwym obszarem naszej pracy będzie sprytne urządzonko o dźwięcznej nazwie "cleanbox" czyli "czyste pudło". Te 2 słowa oddają całą istotę tego sprzętu. Cleanbox jest to prostopadłościan pozbawiony jednej ściany wewnątrz którego utrzymujemy sterylną atmosferę i w którym pracujemy.

Dobrym rozwiązaniem jest użycie szklanego akwarium, które kładziemy na jednym z boków. Można też użyć plastikowego pudła, czy nawet kartonu wyłożonego od wewnątrz folią. Najlepiej całą ideę oddają chyba zdjęcia więc poniżej podaję kilka linków do zdjęć przykładowych cleanboxów:

http://www.kitchenculturekit.com/boxplasticlined.GIF

http://www.kitchenculturekit.com/boxcutout.jpg

http://www.kitchenculturekit.com/orchidTC7.JPG

 

Oraz ciekawy opis nieco bardziej zaawansowanego domowego laboratorium:

http://www.flytrapcare.com/phpBB3/viewtopic.php?f=28&t=3976

Większość  zanieczyszczeń pochodzi z opadającego kurzu/drobin. Jedyne co musimy zrobić, to zabezpieczyć obszar nad kulturami i ograniczyć do minimum ruch powietrza. To właśnie czyni cleanbox osłaniając nasze miejsce pracy.

Bardziej zaawansowanym urządzeniem jest komora laminarna, która tworząc laminarny strumień sterylnego powietrza omywającego miejsce pracy zapobiega atakowi małych intruzów. Strona pomocna każdemu kto myśli o własnej komorze laminarnej:

http://www.orchideenvermehrung.at/cgi-local/framebreaker/reload.pl?english/lfh/index.htm

 

W cleanboxie pracujemy wyłącznie ze sterylnymi kulturami. Wszystkie czynności jakie nie wymagają sterylnej atmosfery [sterylizacja nasion przed umieszczeniem ich na pożywkach, przygotowywanie pożywek] należy wykonywać poza cleanboxem.

Jedyne co musimy zrobić przed rozpoczęciem pracy to spryskać wewnątrz całego cleanboxa alkoholem etylowym [70-90%], bądź izopropylowym [cena- ok. 10-15zł/l]. Można je nabyć np. na allegro. Po spryskaniu wnętrza przecieramy dokładnie całość suchą i czystą szmatką i spryskujemy ponownie. Po ok. 5 min od spryskania możemy zaczynać pracę.

Pamiętaj, że alkohol etylowy i izopropylowy to substancje bardzo łatwopalne! W czasie sterylizacji cleanboxa tymi substancjami nie używaj jakiegokolwiek źródła ognia!

 

Technika pracy

Pracując w warunkach sterylnych, należy pamiętać o 2 rzeczach: grawitacja i ruch powietrza.
Mikroorganizmy obecne są wszędzie, są na naszych rękach, mogą unosić się w powietrzu. Dlatego pracując używamy do dotykania sterylnych kultur i roślin wyłącznie sterylnych narzędzi i nie dopuszczamy do kontaktu materiału niesterylnego ze sterylnym. Wszystkie przedmioty w miejscu pracy również muszą być sterylne. W ten sposób eliminujemy możliwość zakażenia przez bezpośredni kontakt. Inną możliwością infekcji kultur są tzw. zanieczyszczenia opadowe. Jak sama nazwa wskazuje albo spadają one na kulturę z przedmiotów położonych nad nią, albo na skutek ruchów powietrza "wlatują" w nią. W związku z tym nigdy nie przenosimy nad sterylną pożywką rąk, niesterylnych przedmiotów i innych rzeczy mogących "sypać" mikroorganizmami. Dodatkowo unikamy ruchu powierza wewnątrz cleanboxa. Kaszlenie, psikanie czy rozmowa to idealne metody infekowania własnych kultur. Oddychamy poza obszarem cleanboxa. Dla dodatkowego zabezpieczenia można założyć maseczkę przeciwpyłową.

Doświadczenie w pracy przychodzi z czasem jednak dość szybko można wypracować swoje własne,  niezawodne metody postępowania. Obowiązuje zasada nauki metodą "prób i błędów".

Sterylizacja

Wszystkie narzędzia i pojemniki które będą miały kontakt z sterylnymi pożywkami muszą być również sterylne. Najczęściej używanymi narzędziami są pęseta i skalpel. Pęseta powinna być jak najdłuższa i solidna (sam używam 30cm pęset terrarystycznych [również z allegro]). Skalpel. Na poczatku możemy używać po prostu noża kuchennego, ale wygoda jaką daje skalpel z wymienymi jednorazowymi sterylnymi ostrzami medycznymi jest bardzo duża.

Metalowe narzędzia sterylizujemy mocząc je w alkoholu, a następnie opalając DOKŁADNIE nad palnikiem.

Uwaga! Ze względu na zagrożenie pożarem  tą czynność wykonujemy daleko od cleanboxa, jeśli już rozpyliliśmy w nim alkohol!

Nasze narzędzia najlepiej jest przechowywać cały czas w alkoholu - zapobiega to korozji i zapewnia ciągłą sterylność. Czas opalania narzędzi powinien wynosić kilkanaście sekund, tak by mieć pewność, że usunęliśmy wszystkich niepożądanych gości z metalowej powierzchni. Po opalaniu narzędzia są bardzo gorące więc dobrze jest je schłodzić zanurzając w 3% roztworze H₂O₂- czyli po prostu wody utlenionej z apteki. Studzenie możemy też wykonać po prostu wkładając końcówkę pęsety w pożywkę (w przypadku opalania narzędzi w trakcie pracy, które może być krótsze i mniej intensywne niż podstawowe). W trakcie pracy dobrze jest co jakiś czas (10-15 min) zamoczyć pęsetę/skalpel w etanolu i opalić nad palnikiem (poza cleanboxem!)

Przed pracą należy również zadbać o siebie. Proponuję kupić fartuch bawełniany i w nim pracować, dobrze jest też założyć jednorazowe rękawiczki lateksowe i dodatkowo przetrzeć je alkoholem.

Pojemniki z pożywkami których używamy powinny być sterylne, można je przetrzeć z zewnątrz etanolem przed umieszczeniem w cleanboxie. Wewnątrz pożywki muszą być sterylne już po przyrządzeniu! Najłatwiej sprawdzić to wykonując tzw. "ślepą próbę"- umieścić 1 pożywkę z partii pod lampami, w przypadku gdy po miesiącu nic na niej nie wyrośnie - jest sterylna.

Jeśli używamy pożywek z PPM, nie jest konieczne utrzymywanie całkowicie sterylnej atmosfery. Zalety używania tego składnika pożywek są opisane w dziale "pożywki".

Sterylizacja materiału roślinnego jest na tyle szerokim tematem, że będzie traktował o tym osobny artykuł. Wszystkie rośliny które rosną na pożywkach muszą również być sterylne.n Najłatwiej osiągnąć to przez wprowadzanie ich z nasion. Sterylizacja bądź nasion, bądź fragmentów roślin obejmuje ich dokładne mycie, a następnie traktowanie środkiem zabijającym mikroorganizmy, nie niszcząc przy tym materiału roślinnego.

Cleanboxa w celu dezynfekcji można również spryskiwać 10% roztworem wybielacza (Rozwiązanie niezbyt wygodne), bądź roztworem "kwasu nadoctowego"-PAA - mieszanina kwasu octowego z 3% nadtlenkiem wodoru (woda utleniona z apteki). Nie testowałem tego osobiście, ale jak wynika z relacji innych ludzi zajmujących się TC w domu jest to bardzo skuteczny środek.
Otrzymywanie takiego środka dezynfekującego:  zagotować 1 część białego octu o stężeniu 5%, po delikatnym  ostudzeniu dodajemy 4 części 3% nadtlenku wodoru (wody utlenionej). Następnie powstały roztwór przechowujemy w lodówce. Czas przydatności do użycia jest dość długi - minimum miesiąc. Odpada wtedy zagrożenie pożarowe i można opalać narzędzia wewnątrz cleanboxa.