Pożywki.

Czy wiesz, że ... ?

Pierwszy okaz muchołówki (Dionea) przywieziono do Anglii w połowie XVIII wieku. Wzbudziła spore zainteresowanie, gdyż wcześniej nie znano takiej rośliny.

Informacje ogólne

Rośliny owadożerne - hodowla

Pseudoowadożerne

Pożywki.

Autor: Witold Hoffmann (Sativ)

Wstęp

Rośliny rosnące w naturze niezbędne do funkcjonowania substancje pobierają z otoczenia. Środowiskiem życia roślin hodowanych w kulturach in vitro jest niewielki pojemnik hodowlany i znajdująca się wewnątrz pożywka będąca jedynym źródłem substancji pobieranych w trakcie jej wzrostu. W związku z tym skład naszego podłoża jest podstawowym czynnikiem warunkującym szybkość wzrostu rośliny, jej podziału i ukorzeniania, a co najistotniejsze, jest kluczem naszego sukcesu hodowlanego.

Wszystkie składniki mineralne która roślina pobiera w naturze z gleby muszą być zawarte w pożywce. Do podłoża hodowlanego często dodawane są dodatkowo substancje niewystępujące naturalnie, a wpływające na wzrost i rozwój hodowanego organizmu. Rośliny w warunkach in vitro przeprowadzają fotosyntezę w ograniczonym zakresie (zapasy dwutlenku węgla wewnątrz pojemnika są znikome) w związku z tym podłoże musi zawierać źródło węgla konieczne do budowy oraz wzrostu nowych tkanek. Istotnymi składnikami będą również hormony roślinne regulujące różne procesy życiowe.

Pożywki mogą występować w postaci płynnej - wówczas niezbędne jest napowietrzanie kultury, bądź zestalone za pomocą czynnika żelującego - wówczas zabieg napowietrzania nie jest konieczny. Projektując podłoże stosuje się czasem tzw.nośnik pożywki: wata, granulki celulozowe, bądź okruchy skalne. Te techniki jednak nie będą poruszane na łamach tego artykułu.

Najwygodniejsze w użyciu, a za razem polecane przeze mnie na początek będą tzw. pożywki stałe.

Składniki pożywek

Substancje wchodzące w skład pożywek można podzielić ze względu na ich rolę pełnioną w pożywce:

1. Substancje odżywcze i budulcowe.

Mikro i makroelementy.

Rośliny potrzebują do życia i wzrostu raptem kilkudziesięciu pierwiastków. Dzieli się je na makroelementy (stanowiące powyżej 0,1% suchej masy rośliny) oraz mikroelementy. Do makroelementów zaliczamy potas, fosfor, azot magnez, wapń i siarkę, zaś do mikroelementów - żelazo, molibden, mangan, cynk, miedź, bor, chlor, kobalt, wanad, glin i sód. Składniki mineralne wprowadzane są do pożywki w postaci prostych soli nieorganicznych: azotanów, chlorków, siarczanów, fosforanów. Żelazo zaś, ze względu na jego słabą przyswajalność w postaci jonowej, najczęściej wprowadza się w postaci kompleksu z EDTA (kwasem etylenodiaminotetraoctowym, a dokładniej jego solą disodową). Pierwiastki takie jak węgiel, tlen i wodór budują większość suchej masy rośliny. Ponieważ wchodzą one w skład związków organicznych budujących roślinę - głównie celulozy - nazywa się je organogenami. Są one wprowadzane do pożywki w postaci cukrów, witamin oraz aminokwasów. Rośliny w warunkach in vitro nie prowadzą fotosyntezy, więc należy dostarczyć im gotowe półprodukty do budowy tkanek.

Cukry.

Najczęściej używanym cukrem jest sacharoza, jednakże czasem używa się też innych cukrów np. glukozy, rzadziej fruktozy, mannozy czy też galaktozy. Węglowodany są "głównym paliwem" i występują w pożywce w stosunkowo wysokim stężeniu sięgającym kilkudziesięciu gramów na litr. Poza funkcją odżywczą cukry wpływają również na utrzymanie właściwego potencjału osmotycznego pożywki. Z nich właśnie roślina buduje swoje tkanki, dlatego należy zapewnić ich stałe dość wysokie stężenie w pożywce, w celu zachowania szybkiego wzrostu. W tym celu rośliny co kilka tygodni przeszczepia się na nową, świeżą pożywkę.

Aminokwasy.

Aminokwasy są rzadko dodawane do pożywek. Najczęściej do pożywek dodawana jest glicyna, glutamina bądź kwas glutaminowy które przyspieszają wzrost oraz cysteina pełniąca rolę przeciwutleniacza.

Witaminy.

Witaminy stosowane w pożywkach to najczęściej witaminy z grupy B - tiamina, pirydoksyna, kwas nikotynowy, kwas pantotenowy oraz również zaliczany do witamin grupy B cykloheksanheksaol (tak zwany inozytol) będący ważnym składnikiem błony komórkowej.

Zależnie od rodzaju rośliny, stadium hodowli czy też celu jaki chcemy uzyskać używa się pożywek o różnorakim składzie. Niektóre z nich są dość ubogie ponieważ w swoim składzie nie zawierają prawie wcale witamin, aminokwasów oraz mikroelementów, a także mogą posiadać niskie stężenia makroelementów. Inne zawierają wszystkie niezbędne składniki w wysokich stężeniach. które, dla niektórych roślin (np. owadożernych) okazują się być za wysokie. W związku z tym często rozcieńcza się pożywki, zmniejszając stężenia składników, przy zachowaniu całego szerokiego wachlarza związków budulcowych.

2. Regulatory wzrostu.

Bardzo ważnymi składnikami pożywek są regulatory wzrostu czyli tzw. fitohormony. Dodane do pożywek przenikają do tkanek roślinnych i silnie wpływają na rozwój roślin - "sterują" ich wzrostem. Ich działanie zależy od rodzaju tkanki, jej stanu, oraz etapu rozwoju. Dwiema głównymi i najczęściej używanymi w hodowlach in vitro grupami hormonów są auksyny i cytokininy.

Naturalne cytokininy są pochodnymi adeniny. Mają bardzo szeroki wpływ na roślinę. Powstają w podziemnych częściach rośliny skąd transportowane są do innych organów. Pobudzają podział komórek, rozwój merystemów kątowych, hamują wydłużanie się pędów oraz regulują starzenie się roślin - są swoistymi środkami "odmładzającymi". Używa się ich także do przedłużania trwałości ciętych kwiatów, które pod wpływem ich roztworu dłużej zachowują świeżość, kolor i nie więdną tak szybko na skutek pobudzenia syntezy chlorofilu/białek/kwasów nukleinowych.

Najważniejsze cytokininy to:

zeatyna
kinetyna
2-izopentyloadenina (2-iP)
6-benzyloaminopuryna (6-BAP)
tidiazuron (TDZ)

W praktyce "domowej" używa się prawie wyłącznie 6-BAPu oraz kinetyny. Najczęściej stosowane dla nich stężenia mieszczą się w zakresie 0,1- 5,0 mg/litr. Dodane do pożywki w odpowiednim stężeniu. Stosowane zazwyczaj stężenia oscylujące pomiędzy 0,1-2 mg/litr indukują podział roślin, bądź wzrost tkanki kalusowej (bezładne skupisko komórek merystematycznych). Cytokiny mogą być obecne w pożywkach przez cały czas wzrostu, jednakże w znacznie niższych stężeniach (do ok. 0,5mg/litr). To dzięki ich działaniu możemy uzyskać setki roślin z jednego małego fragmentu rośliny.

W handlu cytokiny występują w postaci stałej, bądź roztworów mianowanych 1mg/1ml w 1-molowym roztworze wodorotlenku sodu. Ze względu na użyty rozpuszczalnik są to umiarkowanie żrące roztwory w związku z czym posługując się nimi należy zachować ostrożność.

Auksyny powstają w merystemie wierzchołkowym. Są one naturalnymi przeciwieństwami cytokinin - powodują wydłużanie się pędów, wzrost korzeni, hamują wzrost pędów kątowych. Naturalne auksyny są oparte na szkielecie indolu.

Najważniejsze auksyny to:

kwas indolilooctowy (IAA)
kwas indolilomasłowy (IBA)
kwas naftalenooctowy(NAA)
kwas 2,4 dichlorofenoksyoctowy (2,4D) oraz jego 4-monochloropochodna - 4-CPA

Istnieje wiele syntetycznych auksyn, lecz najczęściej używane amatorsko są tylko 3 z nich: IBA, IAA oraz NAA. Zakres stosowanych stężeń jest dość szeroki (od 0,01 do 10mg/litr). Czasem używa się również mieszanin kilku auksyn. Auksyny, podobnie jak cytokininy, występują w postaci roztworów 1mg/1ml w 1-molowym roztworze NaOH. Należy więc zachowywać ostrożność przy pracy z nimi.

Do pożywek "wzrostowych" auksyny dodaje się w niskich stężeniach (do ok. 0,5-1mg/litr) oraz w wyższych stężeniach (0,2-3mg/litr) w celu ukorzeniania roślin w kulturach. Wysokie stężenia rzędu 5-10mg/litr mogą indukować powstawanie kalusa.

Innymi fitohormonami stosowanymi w pożywkach są gibereliny (przerywają one spoczynek nasion i powodują wydłużanie się pędów roślin), etylen, jasmonidy oraz kwas abscysynowy.

Stosując fitohormony w uprawach in vitro należy pamiętać, że rośliny mają naturalne mechanizmy ich nieuczynniania, dlatego ich stężenie w pożywce z czasem będzie malało.

3. Środki przeciw mikroorganizmom.

Pożywki stosowane w hodowli in vitro są bardzo bogate w związki organiczne - głównie cukry, oraz sole mineralne, co stanowi idealne środowisko do rozwoju bakterii, grzybów oraz glonów. Organizmy te rozrastają się na pożywce o wiele szybciej niż rośliny, zużywając cenne składniki odżywcze i zabijając rosnące na niej rośliny. W związku z tym ich obecność jest bardzo niepożądana. W celu spowolnienia rozwoju, bądź nawet całkowitego jego uniemożliwieniu mikroorganizmom pochodzących z zanieczyszczonej inokulowanej tkanki roślinnej lub innych źródeł takich jak np. powietrze, nie do końca sterylne naczynia i/lub narzędzia, do pożywek dodaje się odpowiednie substancje chemiczne.

Antybiotyki - istnieje bardzo wiele różnych środków, niestety większość z nich ma niewielkie spektrum działania (zwalczają wyłącznie bakterie i to w dodatku tylko wybrane).

Fungicydy - ich dodanie zapobiega rozwojowi grzybów, jednak są one stosunkowo trudno dostępne w czystej formie.

NaDCC - dichloroizocyjanuran sodowy. Używa się go w stężeniach około 30-100mg/litr. Podczas hydrolizy uwalnia on wolny kwas HOCl który wnika wewnątrz tkanek i rozpadając się na wolne rodniki tlenowe zabija mikroorganizmy. Zwalcza wszystkie rodzaje mikroorganizmów i jest dosyć skuteczny.

PPM - Plant Preserwative Mixture. Jego składnikami aktywnymi są dwie izotiazoliny które łatwo przenikają przez błonę komórkową mikroorganizmów i zaburzają łańcuch oddechowy. Są to inhibitory ważnych enzymów oddechowych - dehydrogenaz (NADH, kwasu bursztynowego, kwasu ketoglutarowego). Zaburzenie ich działania powoduje przerwanie dostarczania energii pochodzącej z oddychania tlenowego i co za tym idzie szybką śmierć komórki. Działanie PPM jest o tyle skuteczne, że przenika on przez błonę komórkową wszystkich mikroorganizmów i likwiduje wszystkie z nich (ściana komórkowa komórek roślinnych jest o wiele wolniej penetrowana). W związku z tym jest uniwersalnym środkiem zapobiegającym rozwojowi niepożądanych mikroorganizmów. Jego stężenie w pożywce powinno oscylować pomiędzy 0,5-2ml/litr, najczęściej jednak stosuje się stężenie PPM o wartości 1ml/litr. Takie stężenie zapobiega większości zakażeń "z powietrza"- najczęstszych i najtrudniejszych do uniknięcia w warunkach domowych. Przy stosowaniu PPM jako składnika pożywki nie jest konieczne opalanie narzędzi, oraz dokładnie sterylne środowisko pracy. Z moich doświadczeń wynika, że bez PPM również można pracować w warunkach amatorskich unikając zakażeń, jednak przy jego użyciu komfort pracy znacznie wzrasta przy jednoczesnej minimalizacji zakażeń pochodzących z powietrza. Dla każdego kto myśli o hodowli in vitro w domu PPM jest prawdziwym darem niebios ;)

4. Substancje zagęszczające/żelujące

Najczęściej stosowanym środkiem żelującym jest agar. Jest to wielkocząsteczkowy polimer cukrowy składający się głównie z podjednostek galaktozy. Jest znanym dodatkiem do żywności, pozyskiwany jest naturalnie z morskich wodorostów - głównie brunatnic. W temperaturze powyżej 80-90°C zaczyna dobrze rozpuszczać się w wodzie, jednak w celu całkowitego jego rozpuszczenia należy roztwór doprowadzić do temperatury wrzenia. Zestala się przy ochładzaniu jednak uzyskanie ostatecznej twardości i trwałości wymaga schłodzenie żelu do temperatury pokojowej. Agaru używa się w stężeniu 4-10g/litr. Przy wartości 4g agaru/litr galaretka żelowa będzie bardzo miękka, natomiast stosując stężenie 10g/litr powstanie podłoże bardzo zwarte i twarde. Moim zdaniem najlepsze stężenie agaru zawiera się pomiędzy 4,5-6g/litr (zależnie od zastosowania pożywki) Do wysiewania nasion lepiej zastosować bardziej "luźną" pożywkę, większe rośliny w fazie ukorzeniania będą natomiast wolały bardziej zbite podłoże.

Zamiast agaru stosuje się czasem inne środki np. czystą agarozę, phytagel bądź karagen. W przypadku kiedy nie posiadamy agaru można użyć sterylnej waty jako nośnika dla pożywki (wykładamy ją na dno pojemnika hodowlanego i zalewamy gotową, również sterylną pożywką płynną).

Najpopularniejsze pożywki

Najczęściej używaną pożywką jest podłoże opracowane przez przez Murashigego i Skooga - tak zwane podłoże MS (skrót od Murashige&Skoog). Początkowym jej przeznaczeniem była hodowla tytoniu, ale aktualnie jest używana do hodowli bardzo wielu gatunków roślin. Jest to bardzo bogata pożywka o wysokim stężeniu azotu w związku z tym często stosuje się jej rozcieńczone wersje np. w uprawie roślin owadożernych które wymagają mniej skoncentrowanych wersji pożywki MS. Rozcienczanie to niezbyt skomplikowana czynność. Aby otrzymać np. 1 litr 50% pożywki MS należy zmieszać 0,5l pożywki MS (nierozcieńczanej) z 0,5l wody.

Poniżej znajdują się sprawdzone i bezpieczne stężenia pożywki MS dla roślin owadożernych:

rosiczki- 20-50%

kapturnice- 20-30%

dzbaneczniki- 20-30%

heliamfory- 30%

cefalotusy- 50%

muchołowki- 30-50%

tłustosze- 20%

Stężenie sacharozy dla tych pożywek wynosi 20-30g/litr.

Wśród określonego rodzaju roślin obserwuje się często duże rozbieżności względem najbardziej korzystnego składu pożywki. Czasem podłoże MS nie jest najlepszym wyborem, jednakże ze względu na jej uniwersalność, łatwość w obsłudze i cenę jest zdecydowanie polecanym podłożem dla wszystkich początkujących (wszystkie rośliny owadożerne będą rosły na pożywce MS o odpowiednim dla nich stężeniu). Dla uzupełnienia dodam iż zalecane stężenie sacharozy w pożywce zazwyczaj zawiera się w granicach 20-25-30 gram/litr (osobiście najczęściej stosuję 25 gram sacharozy/litr podłoża).

Oprócz podłoża MS dość często stosowaną pożywką dla roślin owadożernych jest Knudson C - podłoże zaprojektowane do kiełkowania storczyków. Ten typ podłoża dobrze sprawdza się w przypadku dzbaneczników, heliamfor i kapturnic.

Poza wymienionymi podłożami istnieje jeszcze wiele różnorakich pożywek o składach dostosowanych do hodowli określonych roślin. Przykładem mogą być np. WPM - Woody Plant Medium, zaprojektowana do hodowli roślin drzewiastych, pożywka Andersona, Carrola (do hodowli tłustoszy), podłoże Knopa.... Jest to jednak na tyle obszerny temat, że nadaje się na osobny artykuł. Na początku proponuję używać tylko jednej pożywki (MS) w różnych stężeniach, odpowiednich dla każdego rodzaju i/lub gatunku rośliny.

Poniżej podaję przepis na "domową" kompozycję pożywki:

30g cukru spożywczego (używamy go do słodzenia np. herbaty);
0.5g (suchego) nawozu do storczyków 20-10-20 (20-10-20 są to proporcje N, P i K) z mikroelementami, bez mocznika. Można użyć 0,6-0,7ml żelowego koncentratu, bądź poeksperymentować z innymi nawozami - większość się nada (0.5g to ilośc suchej masy nawozu jaką musimy dodać. W przypadku płynnego koncentratu należy przeliczyć w ilu mililitrach płynu mamy 0,5g stałego nawozu);
10 ml roztworu witamin (rozpuszczamy 1 tabletkę multiwitaminy w 100ml wody i pobieramy 10 ml tak uzyskanego roztworu);
6 gram agaru - do kupienia w sklepach z chińską żywnością. Można użyć sterylnej waty którą nasączymy pożywką.

Całość dopełniamy wodą destylowaną do 1litra. Wartość pH uzyskanego roztworu najlepiej doprowadzić do 5-7.

Przygotowywanie pożywki

Przygotowanie pożywki w domowym zaciszu wbrew pozorom nie jest wcale trudne. Cały proces ma na celu umieszczenie użelowanej pożywki w pojemnikach hodowlanych zachowując przy tym jej jałowość. W tym celu najpierw miesza się w odpowiednich proporcjach składniki pożywki, następnie podgrzewa się ją w celu rozpuszczenia środka zelującego - agaru oraz sterylizacji, a na końcu umieszcza w pojemnikach hodowlanych.

Poniżej przedstawię jak przebiega proces własnoręcznego przygotowywania takiego podłoża. Użyte metody, techniki i sprzęt nie są jedynymi możliwymi i można je modyfikować zależnie od posiadanego sprzętu, jednakże schemat jest ten sam.

Potrzebny sprzęt, akcesoria i odczynniki:

źródło ciepła - elektryczna płyta grzejna, kuchenka gazowa, łaźnia wodna (metalowy garnek wypełniony wodą ogrzewany na kuchence gazowej gdzie woda jest czynnikiem przekazującym ciepło);

naczynie do sporządzania pożywki - najkorzystniej szklana kolba, zlewka laboratoryjna, ewentualnie szklane naczynie żaroodporne, dokładnie umyty garnek ze stali nierdzewnej lub emaliowany który nie będzie służył do gotowania jedzenia;

waga elektroniczna - najlepiej z dokładnością 0,01g, ale taka o dokładności 0,1g też doskonale się nada (do nabycia na allegro za 20-40zł). Potrzebna będzie również waga o większym udźwigu i dokładności 1g, bądź dokładny cylinder miarowy ewentualnie duża strzykawka i trochę cierpliwości;

strzykawki z igłami o różnych pojemnościach - do nabycia w aptece;

pojemniki hodowlane - dokładnie umyte słoiki po np. ogórkach, burakach, przecierach pomidorowych (zależnie od pożądanego rozmiaru), bądź pojemniki spożywcze z tworzyw sztucznych;

papierki do pomiaru pH bądź pH-metr;

pęseta, łyżka lub bagietka laboratoryjna do mieszania;

cleanbox- miejsce bez cyrkulacji powietrza możliwe do spryskania wewnątrz etanolem (np.duży plastikowy pojemnik lub karton wyłożony wewnątrz folią);

etanol (spirytus, denaturat) i spryskiwacz;

cukier (np. "diament" ze sklepu nadaje się doskonale);

pożywka MS - w formie proszku bądź koncentratu;

hormony, PPM - w postaci roztworów;

roztwory do nastawiania pH - kwasowy(ok. 1-10% HCl) i zasadowy(1-10% NaOH);[ewenualnie roztwór octu spożywczego i sody oczyszczonej]

odpowiednie miejsce pracy - odporny na zabrudzenia blat/ biurko, odizolowane od bezpośredniego kontaktu z żywnością, należy uszykować trochę starych gazet i ręczników papierowych, zawsze małe ilości pożywki/ odczynników mogą się rozlać;

sprzęt ochronny - stare ubranie, rękawiczki lateksowe (z apteki) i okulary ochronne (do nabycia w sklepie budowlanym).

Na początku musimy dokładnie zaplanować co chcemy zrobić. Przykładowo potrzebujemy kilkanaście pojemników z 30-40ml zestalonej pożywki (w każdym z pojemników). Planujemy, że podłoże będzie miało skład: 25% podłoże MS z dodatkiem sacharozy 25g/litr, 1mg 6-BAP/litr, 1ml PPM/litr, 8g agaru/litr, pH 5,6. Najwygodniej więc będzie wykonać 500 ml takiej pożywki. W 500 ml takiego podłoża musi znaleźć się 125ml 100% MS, 12,5g sacharozy, 0,5mg 6-BAP, 0,5ml PPM oraz 4g agaru. Pozostała część to czysta woda destylowana. Potrzebne ilości obliczamy z proporcji np. jeśli potrzebujemy tylko 200ml pożywki należy użyć 50 ml 100% MS, 5g sacharozy, 0,2mg 6-BAP, 0,2ml PPM oraz 1,6g agaru.

Jeśli posiadamy pożywkę w postaci koncentratu 10x, oznacza to, że np.125 ml 100% MS znajduje się w 12,5ml takiego koncentratu. Pozostałe składniki płynne które dodamy to 0,5ml PPM i 0,5ml BAP. Resztę do 500ml czyli 486,5ml stanowić będzie woda trzeba używać czystej wody destylowanej/demineralizowanej) Ilośc wody została wyliczona ze wzoru: 500ml-13,5=486,5ml. Na wadze (1ml H₂O=1g), strzykawką lub cylindrem miarowym odmierzamy więc zbliżoną ilość wody (lepiej dać delikatny nadmiar, ponieważ cześć wody odparuje w trakcie sporządzania pożywki).

Kolejnym krokiem jest dodanie do wody hormonów, dodatków, pożywki MS w postaci proszku bądź koncentratu, oraz sacharozy (roztwory hormonów mają najczęściej stężenie 1mg/ml w 1N NaOH)

Ponieważ są to substancje niebezpieczne przed przystąpieniem do pracy z nimi przeczytaj zakładkę o bezpieczeństwie pracy (BHP). Załóż okulary ochronne i rękawiczki lateksowe oraz upewnij się, że masz na sobie stare, robocze ubranie.

Jeśli potrzebujemy 0,5 mg hormonu, musimy dokładną strzykawką pobrać 0,5ml roztworu. Jeśli chodzi o PPM to występuje on wyłącznie w postaci gotowego roztworu,. Tutaj również wystarczy pobrać potrzebną ilość i dodać ją do pożywki. Pamiętajmy o odpowietrzeniu strzykawki po pobraniu roztworu! Należy pobrać o ok. 20% większą ilość roztworu, obrócić strzykawkę do góry igłą, przyłożyć do wylotu ręcznik papierowy i stukając w strzykawkę wycisnąć pobrane z cieczą powietrze (przez stukanie w strzykawkę spowodujemy odrywanie się małych bąbelków od ścianek). Nieodpowietrzenie strzykawki spowoduje niedokładność w pobieraniu roztworów.

W taki sam sposób pobieramy koncentrat MS.

Rada. Jeśli potrzebujemy 12,5ml, a dysonujemy strzykawką 5ml to po prostu pobieramy i dodajemy 2x5ml i 1x2,5ml takiego roztworu. Dodajemy go do przygotowywanej pożywki i mieszamy- najwygodniej prętem szklanym, chociaż łyżka ze stali nierdzewnej też się nada.

Odważamy teraz na wadze konieczną ilość sacharozy (12,5g) i dodajemy do roztworu. Mieszamy aż do chwili całkowitego rozpuszczenia kryształków. W międzyczasie szykujemy pęsetę i papierki do pomiaru pH oraz roztwory służące do nastawiania pH pożywki.

Wartość pH jest to "miara" kwasowości roztworu, a dokładniej jest to ujemny logarytm stężenia jonów wodorowych. Do zmieniania pH pożywki służą nam roztwory NaOH i HCl o stężeniu 1-10%. Jeśli chcemy podnieść pH (zmniejszyć kwaśność pożywki) dodajemy roztwór NaOH, w przypadku obniżenia pH (zakwaszania), dodajemy roztwór HCl. Przy dawkowaniu roztworów nastawczych najwygodniej posługiwać się pipetką.

Wartość pH naszego podłoża powinno się zawierać pomiędzy 5 a 6. Dążymy jednak do nastawienia go jak najbliżej wartości 5,6-5,8 która jest optymalna dla warunków które stosujemy. Do pomiaru pH może służyć pHmetr (najwygodniejsza i najdokładniejsza opcja - pHmetry można nabyć np. na allegro za ~100zł) bądź papierki do pomiaru pH. Decydując się na zakup pHmetru należy pamiętać o konieczności jego kalibracji przy pomocy odpowiednich buforów oraz o tym, że elektrody mają swój okres przydatności do użytku. W drugim wypadku najlepiej użyć dwóch kompletów papierków - o pełnej skali pH oraz zawężonych.

Jeśli do ustawiania pH używamy papierków wskaźnikowych wówczas na początku doprowadzamy roztwór do pH 5-6 posługując się przy pomiarach szeroko zakresowymi papierkami. A następnie używamy papierków o zakresie zawężonym.

Po każdym pomiarze pH dodajemy 1-4 krople odpowiedniego roztworu, zależnie od wartości zmiany którą musimy wywołać oraz stężeń używanych roztworów. Lepiej dodawać je powoli, niż za szybko. - może wówczas powstać duża ilość niechcianego KCl który powstaje kiedy "skaczemy" na przemian w górę i w dół skali pH.

Pierwszym krokiem przy "nastawianiu pożywki" jest pomiar pH bez dodawania jakichkolwiek roztworów. Zanurzamy pasek testowy w badanym roztworze na ok. 1 sec. i porównujemy z porównawczą skalą barwną:

W tym wypadku pH pożywki wynosi ok. 8,5. (Uwaga- zdjęcia nie oddają dobrze barw, najlepiej widać to "na żywo").

W celu osiągnięcia oczekiwanego pH 5,6 należy dodać roztworu HCl - około 4 kropli. Po bardzo dokładnym wymieszaniu badamy pH ponownie:

Wartość pH wynosi teraz około 7,5 więc kontynuujemy zakwaszanie.

Teraz pH wynosi około 5,5, w zakresie pH 3-7. Ponieważ papierki o zawężonym zakresie nie są zbyt dokładne, dlatego w tym momencie należy "przestawić się" na dokładniejsze papierki wskaźnikowe:

Okazuje się, że pH jest niższe niż 5,4. Dodajemy więc 2 krople roztworu NaOH, dokładnie mieszamy i kontynuujemy pomiary. Otrzymujemy wartość pH na poziomie 5,8. Jest to już pożądana przez nas wartość pH. Zawsze lepiej jest uzyskać nieco wyższe pH ponieważ w trakcie gotowania pożywki jego wartość nieco spadnie.

Co stanie się jeśli przez nieuwagę dodamy jeszcze 2 krople NaOH ? Wartość pH oczywiście zwiększy się (tutaj do wartości 6,2):

Porównanie dokładności pomiaru papierkami pH-metrem - ten sam roztwór w obu próbach.

W celu otrzymania odpowiedniego pH do takiego roztworu należy dodać jeszcze 1-2 krople roztworu HCl sprawdzając odczyn papierkami. Jak widać jest to dość dokładna metoda.

Procedura wydaje się skomplikowana lecz po kilku próbach dochodzi się do wprawy. Należny jedynie pamiętać, że roztwory nastawcze trzeba dodawać naprawdę powoli. Skala pH jest skalą logarytmiczną, dlatego zmiana pH z 2 do 3 wymaga dodania o wiele większej ilości NaOH niż z z wartości 6 do 7 (ilości dodawane na "skrajach" skali między pomiarami mogą być dość spore, ale przy "końcówce" nastawiania należy dodawać nawet po 0,5 kropli i bardzo dokładnie mieszać).

Kiedy mamy już gotową płynną pożywkę z nastawionym pH, wstawiamy ją na płytę grzejną, gaz lub do łaźni wodnej i w między czasie zaczynamy szykować "sterylny plac boju"- cleanboxa (sam używam komory laminarnej, dlatego zdjęcia pokazują nalewanie pożywki w takiej komorze).

Zaczynamy od przygotowania pojemników. Muszą one być uprzednio dokładnie umyte detergentem, przepłukane przez 5-10 min 20% wybielaczem, wypłukane wodą destylowaną i wysuszone ręcznikami papierowymi. Tak przygotowane pojemniki zalewamy małą ilością etanolu i wstrząsamy, tak by pokryć nim całą wewnętrzną powierzchnię. Nadmiar przelewamy do kolejnego słoiczka, poprzedni zakręcamy i wstawiamy do mytego etanolem i spryskanym od wewnątrz tym samym etanolem cleanboxa. Kiedy wszystkie pojemniczki są już przepłukane wycieramy z nich do sucha nadmiar etanolu ręcznikami papierowymi. Zakręcamy je i zostawiamy w cleanboxie.

(Sam używam jednorazowych pojemników polipropylenowych i sterylizuje je promieniami UV).

Warto już teraz przygotować rękawice którymi będziemy chwytać gorący pojemnik z pożywką, spryskać jeszcze raz cleanboxa etanolem i upewnić się, że wszystko wewnątrz jest gotowe do pracy.

W czasie gdy szykowaliśmy cleanboxa pożywka powinna już trochę się nagrzać. Kiedy osiągnie temperaturę ok. 60-80ºC należy dodać do niej czynnik żelujący - agar. Odważamy go dość dokładnie na wadze:

Ja zawsze wolę dać nieco więcej agaru ponieważ przywiera on do używanych przeze mnie szalek petriego i dodana ilość może nie zgadzać się z odważoną wcześniej porcją. Kiedy mamy już odważony agar dodajemy go do naszej pożywki dobrze mieszając.

Zależnie od źródła każdy agar ma nieco inne właściwości żelujące i odpowiednie jego ilości będzie trzeba dobrać na podstawie własnych doświadczeń. Stężenie 7-8g/litr wydaje się jednak stężeniem uniwersalnym.

Po dodaniu agaru powstały koloid będzie wyglądał mniej więcej tak:

Całkowite rozpuszczenie agaru wymaga doprowadzenia roztworu do wrzenia. Dodatkowo 10 minutowe gotowanie w połączeniu ze stosowaniem PPMu skutecznie eliminuje mikroorganizmy, co zaoszczędza dużo pracy z późniejszym stosowanym zazwyczaj autoklawowaniem (które w warunkach domowych jest trudne do przeprowadzenia).

W miarę rozpuszczania się agaru grudki będą zanikać, a ciecz będzie stawać się coraz bardziej klarowna. Może występować obfite pienienie się. Wrzący roztwór należy dość dobrze mieszać przez ok. 10 minut. Wrzenie nie powinno być zbyt intensywne, by nie odparowała za duża ilość wody. nadmiernemu ubytkowi wody można zaradzić dodając odpowiedni nadmiar wody na początku.

Kiedy roztwór będzie już półprzeźroczysty wówczas jest on gotowy do rozlania do pojemników.

Przychodzi moment kiedy konieczny jest ubiór z długim rękawem oraz czyste rękawiczki lateksowe które przecieramy etanolem (w calu uniknięcia zakażenia pożywek).

Na chwilę przed zdjęciem przygotowanego agaru ze źródła ciepła spryskujemy jeszcze raz cleanboxa etanolem i odkręcamy pojemniki. Zdejmujemy wciąż lekko wrzący pojemnik z pożywką (para wodna stanowi tu barierę dla mikroorganizmów) i rozlewamy ją do pojemników:

Jeśli pożywka jest przeznaczona dla niewielkich roślin wówczas pojemnik napełniamy na ok. 1,5cm grubą warstwą pożywki. Nasiona mogą mieć 1cm warstwę, większe ilości, większych roślin powinny mieć 2-3 cm warstwę pożywki. Podczas nalewania nie wolno nam wywoływać zbytniego ruchu powietrza, oddychać nad pożywkami (należy oddychać tak by powietrze wydychane wylatywało nad cleanboxem) ani za intensywnie przenosić nad nimi rąk. Unikamy też kontaktu z wewnętrznymi powierzchniami nakrętek i wewnętrznych ścianek pojemników.

Po nalaniu pożywki pojemniki szybko zakręcamy i zostawiamy do wystygnięcia. Pożywka musi stygnąć ok. 3-4godzin zanim stanie się w miarę twarda. Pełna wytrzymałość mechaniczna jest osiągana po schłodzeniu do temperatury pokojowej.

Teraz wystarczy tylko opisać wszystkie pożywki. Najwygodniej jest to zrobić przy pomocy etykiet samoprzylepnych drukowanych na komputerze. Inną metodą oznaczania pożywek jest dodawanie do nich barwników spożywczych z określonym kolorem odpowiadającym danemu typowi pożywki. Niestety powyżej 4-5 rodzajów pożywek brakuje już kolorów...

Zasady BHP

Hormony, roztwory do nastawiania pH oraz PPM są substancjami drażniącymi. Stężenia stosowanych przez nas kwasów i zasad są dość niskie, ale przy dłuższej ekspozycji mogą wywołać uszkodzenia skóry. W przypadku zanieczyszczenia skóry którymś z tych roztworów należy jak najszybciej zmyć ją dużą ilością bieżącej wody, a w razie ewentualnych problemów należy bezzwłocznie zgłosić się do lekarza. W przypadku dostania się niebezpiecznego roztworu do oka należy natychmiast przemyć je dużą ilością wody i profilaktycznie zgłosić się do lekarza.

Na miejscu pracy nie powinno się jeść ani pić, a substancje nie powinny mieć kontaktu z żywnością. Zasadniczo używane odczynniki są bardzo bezpieczne w porównaniu z większością chemikaliów używanych w laboratoriach, ale w przypadku braku wyszkolenia należy na nie nie uważać. Nie trzeba panikować lecz pamiętać, że nie są to zabawki. Wówczas jakiekolwiek zagrożenie jest minimalne. W przypadku rozlania jakiegoś roztworu wystarczy wytrzeć go ręcznikami papierowymi, a miejsce przepłukać wodą i ponownie wytrzeć.